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2024年7月山东大学丁兆军教授团队在Advanced Science（IF=14.3）杂志上发表题为“VIK-Mediated Auxin Signaling Regulates Lateral Root Development in Arabidopsis”文章。研究采用磷酸化修饰组学、LC-MS/MS质谱分析、CO-IP、酵母双杂和荧光素酶互补成像等技术，发现VIK介导的生长素信号转导分别通过增强LBD18的蛋白质稳定性和诱导ERF13的降解来调节侧根发育。拜谱生物为该研究提供了磷过酸遮盖组学、LC-MS/MS磷过酸位点解析技术服务。
英语标题格式：VIK-Mediated Auxin Signaling Regulates Lateral Root Development in Arabidopsis（Advanced Science，IF=14.3，2024.07）
常常题头：VIK介导的生长素信号调节拟南芥侧根发育
买家院校：山东大学
探析建材：拟南芥侧根
拜谱提供数据枝术：磷过酸表达组学、LC-MS/MS磷过酸位点定量分析
实验指导思想：
PART 01 探索最终结果
01、繁殖素推动VIK的磷过酸基本转录
为了鉴定生长素触发的潜在磷酸化调控因子，作者对10日龄拟南芥幼苗根用10 µM 萘乙酸（NAA）处理15分钟和8小时后进行磷酸性反应核氨基酸混合物析，结果发现VIK可能通过磷酸化修饰在介导生长素信号传递中发挥关键作用（图1A）。
图1 滋生素增进VIK的磷碱化基本转录
为了验证上述结果，作者在大肠杆菌中表达了带有6个组氨酸标签的重组VIK蛋白（His-VIK），并在细胞自由蛋白系统中进行了磷过酸研究。发现His-VIK随着时间的推移磷酸化水平略有增加。在野生型拟南芥幼苗的根组织裂解液中，NAA处理15分钟和30分钟后，His-VIK的磷酸化水平显著增加，表明生长素能显著促进VIK的磷酸化（图1B）。
通过酵母菌双交配定性分析（Y2H）和烟草叶片中的荧光素酶相容成相进行实验（LCI）证实了VIK与TMK1之间存在直接相互作用，并且休外磷酸性反应实验表明TMK1可以磷酸化VIK。通过生成ProVIK:VIK-GFP转基因系进行的蛋白降解实验显示生长素可能不影响VIK蛋白的稳定性（图1C）。城市热力图参考值PCR分析发现，生长素处理能时间依赖性地诱导VIK转录水平的增加（图1D），且这种诱导主要通过ARF7/19依赖性方式实现，在arf7/19突变体中VIK表达的诱导明显减弱，而在lbd16/18/33突变体中VIK表达仍能被生长素显著诱导。
02、VIK 介导的叶绿素网络信号充分宏观调控 LR 发肓
在深入分析好几个VIK T-DNA导入变动体（vik-2和vik-3），意味着与野外型好于，变动体的LR规格、LR原基（LRP）和已胸部發育成熟的LR偏态缩短，十分是vik-2（图2）。不同，过表达方式爱VIK的转什么是遗传基因植物体展现出LR规格曾加。然而，在vik-2变动体原型下表达方式爱VIK的转什么是遗传基因植物体恢愎了LR胸部發育成熟疵点。植物的出现素解决调查意味着，vik-2变动体对植物的出现素引诱的LR胸部發育成熟表现弱化，意味着VIK在植物的出现素调节LR胸部發育成熟中展现要点用处。 
图2 VIK介导的植物的生长素讯号通道顺向房产调控LR的生长发育
03、VIK 与ERF13 进行物理学互动
研究发现VIK在生长素诱导的侧根（LR）发育中扮演关键角色，因此推测ERF13可能是VIK的潜在底物。通过Y2H、LCI、双原子核荧光互补原理 （BiFC）和免疫抗体共滤渣实验英文（CO-IP），证实了VIK与ERF13之间存在直接的相互作用（图3）。这些结果表明VIK与ERF13在物理上相互作用，支持了ERF13可能是VIK作用底物的假设。
图3 VIK与ERF13完美目的
04、VIK以正反两面馈的办法调节ERF13磷酸性反应
通过磷硝化作用蛋白质组学研究分析，发现NAA处理可快速诱导ERF13磷酸化。体外实验表明，VIK具有自磷酸化活性，并可直接磷酸化ERF13的Ser168和Ser172位点（图4）。点突变率表明显著降低了ERF13的磷酸化水平。此外，ERF13可增强VIK的自磷酸化，尤其是ERF13的磷酸模拟突变体。进一步实验表明，VIK可通过形成同源二聚体进行自磷酸化，但ERF13突变体不影响VIK二聚体的形成。总体而言，VIK通过反馈机制调控ERF13的磷酸化。
图4 VIK以双面馈措施磷碱化ERF13的Ser168和Ser172位点
05、VIK介导的磷酸性反应推动ERF13可降解
研究发现，VIK介导的磷酸化作用影响ERF13蛋白的稳定性，进而调控侧根发育。实验显示，ERF13蛋白在早期侧根原基中表达，随后在发育过程中消失，而VIK蛋白在所有侧根中持续表达（图5）。通过离体试验室和人体内试验室，发现VIK能够促进ERF13的降解。进一步通过磷酸虚拟和磷酸降解基因突变体的实验，证实了ERF13在Ser168和Ser172位点的磷酸化促进了其降解。此外，VIK与MPK14可能协同作用促进ERF13降解，但两者之间没有直接的相互作用。最后亚神经元导航定位讲解表明，ERF132D和ERF132A均位于细胞核，且与WT无明显差异。qRT-PCR结果显示，vik-2突变体中ERF13 mRNA水平未显著变化，但其下游基因KCS8和KCS16显著降低，进一步证明VIK在蛋白水平上调控ERF13。总之，VIK介导的磷酸化通过负调控ERF13的稳定性，加速生长素诱导的ERF13降解。
图5 VIK 介导的磷过酸促使了ERF13光降解
06、VIK 介导的 ERF13 磷酸性反应转换 LR 的导致
探究进一次浅析了VIK自我调节的ERF13分解在侧根（LR）阴茎发育中的意义。使用更加不一转基因水稻组绿色蕨类草木系的LR表型，体现了过体现了ERF13减退了LR的有，在vik突变的体中本身减退意义增强学习，而在过体现了YFP-VIK的的背景下本身减退意义减退（图6）。前者，更加ERF13的不一磷酸性反应仿真仿真模拟和磷酸灭活进化体的过体现了绿色蕨类草木系，体现了ERF132A-Myc（磷酸灭活）的绿色蕨类草木系LR有少得多，而ERF132D-Myc（磷酸性反应仿真仿真模拟）的绿色蕨类草木系LR有略多。那些但是体现了，VIK介导的ERF13磷酸性反应和分解有助于了LR的有。 
图6 VIK介导的ERF13磷过酸力促LR的出现了
07、VIK在侧根阴茎发育中磷碱化并维持LBD18蛋清
完成定性分析两根VIK T-DNA嵌入突然变化体（vik-2和vik-3），发展与野生植物型优于，突然变化体的侧根（LR）体积计算公式、LR原基（LRP）和已胸部发肓的LR可观避免，需要是vik-2（图7）。颠倒，过表现方法VIK的转DNA植物体主要表现出LR体积计算公式加入。然而，在vik-2突然变化体游戏背景下表现方法VIK的转DNA植物体可以恢复了LR胸部发肓常见问题。生長素办理實驗是因为，vik-2突然变化体对生長素引导的LR胸部发肓发应弱化，是因为VIK在生長素控制LR胸部发肓中利用根本的作用。 
图7 VIK 在LR演变成过程中中就直接磷碱化和安全稳定LBD18核蛋白
PART 02 散文个人总结
生长素作为最重要的植物激素之一，在调控植物生长和发育过程中起着关键作用。这项研究通过磷硝化作用高蛋白质组学分折筛选到快速响应生长素的蛋白激酶VIK，并证实VIK通过调控LBD18和ERF13来调控侧根的形成。一方面，生长素以ARF7/19依赖的方式诱导VIK的转录；另一方面，它通过TMK1激活VIK的激酶活性，激活的VIK可以磷酸化LBD18和ERF13。磷酸化的LBD18变得更加稳定，调节侧根的启动。然而，磷酸化的ERF13经历降解，缓解了其对侧根出现的抑制，从而促进侧根的形成（图8）。VIK的发现不仅丰富了我们对生长素信号传递机制的理解，而且为农业生产中通过调控生长素信号来提高作物产量和抗逆性提供了潜在的策略。
图8 VIK介导的种植素走势调低侧根建立
PART 03 拜谱个人心得体会
研究采用磷酸化修饰组学、LC-MS/MS质谱分析、CO-IP、酵母双杂和荧光素酶互补成像等技术，发现 VIK 介导的生长素信号转导分别通过增强 LBD18 的蛋白质稳定性和诱导 ERF13 的降解来调节 LR 发育。拜谱生物作为一家国内领先的多组学服务公司，可提供完善成熟的蛋清质组学、遮盖蛋清质组学、排泄组学、转录组学等多组学产品技术服务体系。拜谱特色磷酸化修饰产品—超低深浅DIA·磷过酸绘制组，采用创新含有技術+Astral DIA，超高深度赋能低丰度磷酸化蛋白/位点发掘，单针最高可实现哺乳动物模本10w+、花草模本5w+磷酸化修饰位点检出，可广泛应用于植物、动物研究，绘制物种磷酸化修饰图谱，助力高分文章发表。此外，磷酸化修饰组学可与蛋白组学、代谢组学等多组学联合，整合多组学数据进行深入挖掘分析，全面解析机制机理等。欢迎咨询！
参照期刊论文：
Shang E, Wei K, Lv B, Zhang X, Lin X, Ding Z, Leng J, Tian H, Ding Z. VIK-Mediated Auxin Signaling Regulates Lateral Root Development in Arabidopsis. Adv Sci (Weinh). 2024 Jul 3:e2402442. doi: 10.1002/advs.202402442. Epub ahead of print. PMID: 38958531.
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